genetičko inženjerstvo (tehnologija rekombinantne DNA), niz postupaka i tehnika za dobivanje rekombinantne DNA (rDNA), sastavljene od molekula DNA, uglavnom iz različitih organizama. S pomoću rDNA unosi se precizna promjena u određene gene kako bi se genom organizma ili populacije genetički preinačio (modificirao); rDNA najčešće se prenosi u nesrodnu stanicu domaćina u kojoj se umnožava, a potom se u većini slučajeva eksprimira, tj. informaciju zapisanu u DNA prevodi se u protein (genska ekspresija).
Ako se genom namjerno preinačuje na način drukčiji od prirodne rekombinacije i indukcije mutacija, odnosno ako se uvodi strani gen u genetički materijal organizma ili se dio genetičkoga materijala uklanja tehnologijom rekombinantne DNA, nastaje genetički modificirani (preinačeni) organizam (engl. genetically modified organism, GMO); rabi se i izraz GM-organizam te transgeni organizam (organizam koji u svojim stanicama sadržava transgen, tj. gen koji potječe iz nekoga drugog organizma ili vrste). Metoda genetičkoga inženjerstva je i kloniranje, postupak dobivanja skupine genetički jednakih molekula, stanica ili jedinki, gotovo identičnih ishodišnoj molekuli, stanici ili organizmu (zbog uobičajenih mutacija i epigenetičkih utjecaja ne mogu biti potpuno identični). U novije doba primjenjuju se postupci prepravljanja postojećih gena u genomu organizma (engl. genome editing) s pomoću metode CRISPR/Cas (engl. clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR-associated protein).
Razvoj genetičkoga inženjerstva
Razvoj genetičkoga inženjerstva započeo je potkraj 1960-ih otkrićem enzima potrebnih za prekrajanje DNA. Werner Arber, Hamilton Othanel Smith i Daniel Nathans u bakterijama su otkrili restrikcijske endonukleaze (→ nukleaze), koje prepoznaju i cijepaju točno određene redoslijede nukleotida u DNA, pa se mogu rabiti kao tzv. molekularne škare za DNA. Za otkriće i primjenu restrikcijskih enzima u bakterija dobili su 1978. Nobelovu nagradu za fiziologiju ili medicinu. Prvi enzim iz skupine DNA-ligaza (→ ligaze) kojim je moguće spajati dvije molekule DNA otkriven je 1967., a 1984. Kary Banks Mullis otkrio je metodu lančane reakcije polimerazom (engl. polymerase chain reaction, PCR) kojom se male količine DNA umnožavaju in vitro u mnogobrojne identične kopije te je za to otkriće, s Michaelom Smithom, dobio Nobelovu nagradu za kemiju 1993. Navedenim otkrićima ustanovljene su metode kojima se molekule DNA mogu izolirati, cijepati, spojiti, ugraditi u vektore i umnožiti u milijardama primjeraka.
Paul Berg prvi je ostvario zamisao o spajanju dviju molekula DNA iz različitih organizama u epruveti, ugradnjom bakterijskoga gena za metabolizam galaktoze u virusnu DNA (1972), pa se upravo on smatra utemeljiteljem genetičkoga inženjerstva. Njegov rad potaknuo je daljnja istraživanja unosa rekombinatnih molekula DNA u stanice i njihove ekspresije. Nakon Bergova otkrića, Stanley Cohen i suradnici 1973. uspješno su in vitro konstruirali funkcionalni rekombinantni bakterijski plazmid (pSC101). Napretku genetičkoga inženjerstva znatno je pridonijelo sekvenciranje DNA, npr. međunarodnim Projektom ljudskoga genoma (engl. Human Genome Project, HGP), koji se odvijao 1990–2003. s ciljem određivanja slijeda nukleotida i položaja gena u cjelokupnom ljudskom genomu. Razvojem novih metoda sekvenciranja (2005), odnosno sekvenciranja nove generacije (engl. next generation sequencing, NGS; sinonim je i masivno paralelno sekvenciranje), znatno se povećala brzina i smanjili su se troškovi postupka sekvenciranja genoma.
Slijedio je golem napredak otkrićem novih oruđa za precizno uređivanje genoma: 1991. otkriveni su ZF-proteini, proteini sa strukturnim motivom cinkova prsta (engl. zinc-finger, ZF) na temelju kojih je konstruirana kimerna nukleaza ZFN (engl. zinc finger nuclease) za modifikaciju genoma, sa sposobnošću prepoznavanja specifičnoga slijeda nukleotida u DNA, a 2005. načinjena je fuzija dijela endonukleaze Fok I sa ZF-proteinom koja se također primjenjuje za ciljano uređivanje genoma. Otkriće proteina TALE (engl. transcription activator-like effector) i razvoj sustava TALEN (engl. transcription activator-like effector nucleases) omogućio je preciznije uređivanje genoma mnogih organizama (2010).
Posljednje revolucionarno otkriće u genetičkome inženjerstvu ostvareno je 2012. kad su Jennifer Doudna i Emmanuelle Charpentier otkrile sustav za ciljanu modifikaciju genoma CRISPR/Cas9. Taj sustav prirodno služi bakterijama za obranu od bakteriofaga, a njegova uporaba u genetičkom inženjerstvu omogućava još uspješnije, jednostavnije i preciznije uvođenje genetičkih modifikacija u živu stanicu.
Prvi GM-organizam u svijetu bila je bakterija Escherichia coli (E. coli) otporna na antibiotik kanamicin, a stvorili su je 1973. američki genetičar Stanley Cohen i američki biotehnolog Herbert Boyer. Boyer, Arthur Riggs i Keiichi Itakura iz poduzeća Genentech prvi su 1977. eksprimirali ljudski gen u bakteriji i tako proizveli hormon somatostatin. Rekombinantni humani inzulin prvi je put proizveden tehnologijom rekombinantne DNA u istom poduzeću (1978). Prvoga GM-sisavca, miša, stvorio je američki molekularni biolog Thomas Edwards Wagner 1974. na Državnom sveučilištu Ohio u Columbusu. Prvu GM-bakteriju patentirao je 1981. indijsko-američki mikrobiolog Ananda Mohan Chakrabarty iz poduzeća General Electric Company; pripadala je rodu Pseudomonas, metabolizirala je masnoće te ujedno predstavlja prvi patentirani živi GM-organizam. Prva GM-biljka, duhan otporan na antibiotike, proizvedena je 1983., a prva komercijalno dostupna GM-biljka bila je rajčica naziva Flavr Savr s većom otpornosti na truljenje (1996). Imala je ugrađeni gen s reduciranom aktivnošću enzima koji hidrolizira pektin (normalna aktivnost enzima uzrokuje prerano sazrijevanje ploda), ali je poslije povučena s tržišta. Prvi klonirani sisavac, ovca Dolly, stvoren je 1996. u škotskom Institutu Roslin. Iako je prosječni životni vijek ovce 14 godina, Dolly je uspavana 2003. u dobi od šest godina jer je bolovala od tumora pluća, mnogobrojnih kroničnih bolesti, a pokazivala je i znakove preranoga starenja.
U Hrvatskoj su tehnologiju rDNA za niz osnovnih i primijenjenih istraživanja rabile istraživačke skupine okupljene oko Instituta Ruđer Bošković (IRB), farmaceutskoga poduzeća Pliva i sastavnica Sveučilišta u Zagrebu, napose Prehrambeno-biotehnološkoga fakulteta i Prirodoslovno-matematičkoga fakulteta u Zagrebu. Razvoj metoda genetičkoga inženjerstva u Hrvatskoj započeo je 1970-ih na zajedničkom projektu IRB-a i Plive, u okviru kojega se istraživala konstrukcija stabilnih bifunkcionalnih vektora (dvojnih plazmida) za prijenos gena između bakterija roda Streptomyces, važnih industrijskih proizvođača antibiotika, i bakterije E. coli; rezultat projekta bila je konstrukcija prvoga rekombinantnoga plazmida u Hrvatskoj (pZG1).
Primjena genetičkoga inženjerstva
Tehnologija rekombinantne DNA danas je vrlo raširena i nalazi primjenu u biotehnologiji, biokemijskom inženjerstvu, medicini, poljoprivredi te u fundamentalnim i primijenjenim znanstvenim istraživanjima.
U medicini se genetičko inženjerstvo rabi u proizvodnji lijekova (biofarmaceutika), osobito terapeutskih proteina (inzulin, interferon, hormon rasta, čimbenici rasta, čimbenici zgrušavanja), potom u dijagnostici (proizvodnja protutijela), sekvenciranju genoma te identifikaciji gena za različite bolesti. Jedna od primjena genetičkoga inženjerstva proizvodnja je cjepiva (→ cijepljenje) temeljenih na metodama rekombinantne DNA (rekombinantna cjepiva). To su primjerice cjepivo protiv hepatitisa B, odobreno za uporabu 1986., potom cjepivo protiv infekcije humanim papilomavirusom (HPV), odobreno za uporabu 2006., te vektorska cjepiva protiv bolesti COVID-19 (Vaxzevria i Jcovden), odobrena za uporabu 2021. Prva genska terapija na čovjeku provedena je 1990. u SAD-u primjenom terapijskoga gena na četverogodišnjoj djevojčici u svrhu liječenja nasljedne monogenske bolesti, teške kombinirane imunodeficijencije koja proizlazi iz manjka enzima adenozin-deaminaze.
U poljoprivredi se genetičko inženjerstvo rabi za proizvodnju biljaka otpornih na herbicide, sušu, hladnoću, visoku temperaturu, nepovoljne uvjete skladištenja i transporta, te za proizvodnju biljaka veće prehrambene vrijednosti. Primjerice, sojevi bakterije Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis, Bt) sintetiziraju proteinske toksine što se izlučuju kao insekticidni proteini (Bt-toksini, npr. Cry, Cyt) i toksično djeluju na širi spektar kukaca koji nanose gospodarske štete na urodima, uključujući redove dvokrilaca, leptira i kornjaša. Bt-toksini rabe se u obliku komercijalnih biopesticida ili kao transgeni usjevi (Bt-usjevi s ugrađenim genom iz B. thuringiensis). Takve genetički izmijenjene Bt-biljke nakon ugradnje gena za toksin iz B. thuringiensis same proizvode navedeni protein koji pruža biljci zaštitu od kukca. Gen za Bt-toksin uveden je u više od 50 biljnih vrsta, a od 1996. Bt-usjevi otporni na kukce uzgajaju se diljem svijeta. Američka Agencija za zaštitu okoliša (engl. Environmental Protection Agency, EPA) dopustila je 1998. proizvodnju Bt-kukuruza pod komercijalnim nazivom Starlink s uvedenim Bt-genom cry9C i genom za otpornost na herbicid glufosinat (danas se više ne uzgaja). Od iste se godine u Europi komercijalno uzgaja Bt-kukuruz MON810 poduzeća Monsanto (danas Bayer CropScience).
Genetički modificirani organizmi u hrani
Genetički modificirana hrana sadržava genetički modificirane organizme (sastoji se od njih ili je od njih proizvedena). Ukupno je poznato 16 genetički modificiranih komercijalnih biljnih vrsta, a to su kukuruz, soja, pamuk, uljana repica, rajčica, krumpir, šećerna repa, riža, pšenica, karanfil, bundeva, duhan, cikorija, lan, dinja i papaja. EU uvelike ovisi o proizvodnji biljnih proteina iz zemalja izvan EU u kojima je uzgoj GMO-a raširen (npr. Brazil, Argentina, SAD), napose soje za prehranu životinja, pa uvozi znatne količine genetički modificirane hrane za životinje (više od 60%), no vrlo malo genetički modificirane hrane za ljude.
U EU-u je do danas izdano više od 50 odobrenja za korištenje GM-biljaka za prehranu ljudi i domaćih životinja (pamuk, kukuruz, uljana repica, soja i šećerna repa), ali je samo jedno odobrenje dano za uzgoj GM-usjeva – GM-kukuruza MON810 koji je otporan na kukuruznog moljca (Ostrinia nubillalis). Sadržava Bt-gen cry1Ab, gen za otpornost na herbicid glifosat i gene za otpornost na antibiotike neomicin i kanamicin. Uzgaja se najviše u Španjolskoj i Portugalu, a 16 država EU-a, uključujući i Hrvatsku, zabranilo je njegov komercijalni uzgoj. Genetičke se modifikacije sve više primjenjuju i na pojedinim životinjskim vrstama kao što su ribe, kokoši i svinje, ali je hrana životinjskoga podrijetla nastala uporabom tehnika genetičkoga inženjerstva u EU-u zabranjena.
EU ima stroga pravila i složen postupak odobravanja, uzgoja i prodaje GMO-a, a od 2015. države članice samostalno odlučuju dopuštaju li uzgoj takvih biljaka na svojim područjima. Zakonodavstvom EU-a propisano je obavezno označivanje (deklariranje) proizvoda koji sadržavaju GMO, od njega se sastoje ili su proizvedeni od njega. Označivanje proizvoda obvezno je za namirnice koje sadržavaju GMO-e dopuštene u EU-u u količini većoj od 0,9% masenoga udjela, dok za količine ispod toga praga označivanje nije obvezno, pa tako proizvod može sadržavati tragove GMO-a (manje od 0,9%).
